发布日期： 2024-09-20 14:01:02 来源：贝博BB平台app免费下载
miR-205-3p在氧糖掠夺-复氧复糖星形胶质细胞胀亡中的效果：与AQP4的联系
miR-205-3p参加了OGD/R星形胶质细胞胀亡的进程，与调控AQP4表达有关。
缺血性脑卒中是一种因为脑或颈部血管堵塞导致脑血流缺乏而引起的破坏性脑血管疾病[1]，其康复血流后的再灌注损害会构成更严峻的脑安排和神经细胞损害[2]。脑缺血产生后会促进导致脑水肿，脑水肿包含血管源性水肿和细胞毒性水肿。其间细胞毒性水肿是因为星形胶质细胞的功用障碍引起很多水分子进入细胞，从而引起细胞水肿[3]。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰厚的细胞类型，在保持微环境的稳定性和神经回路功用方面发挥着至关重要的效果[4,5]，且其水通道蛋白4(AQP4)的表达与细胞水肿程度联系密切[6]，可导致星形胶质细胞胀亡[6,7]。MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性非编码RNA，以大多数蛋白质编码转录本为靶标，可参加各种要害的病理生理进程。研讨标明，反常miRNAs的表达在缺血性脑卒中和其他病理进程中发挥及其重要的效果[8]。miR-205在多种细胞中均有表达，如神经细胞[9]、肾细胞等[10，且miR-205已被证明在大鼠缺血缺氧性脑损害中表达下调[11]。本研讨拟点评miR-205-3p在氧糖掠夺-复氧复糖(OGD/R)星形胶质细胞胀亡中的效果及其与AQP4的联系，为清晰其机制供给参阅。
本研讨获医院医学道德委员会同意(同意号：2022临审字第021号)。取0～2 d重生昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒后，断头取大脑皮层安排，剥除脑膜和血管，重复轻柔吹打制成细胞悬液，过滤，搜集滤液，转入75 ml培育瓶中，置于37 ℃、5%CO2培育箱(Gibco公司，美国)中静置培育。参加0.25%胰酶于37 ℃温箱中消化，参加彻底培育基停止消化，离心搜集细胞沉积，重悬于彻底培育基中，接种于培育瓶，置于37 ℃、5%CO2的培育箱中。每2 d换1次液，7 d后37 ℃、180转/min震动18 h换液，待细胞到达对数成长期(密度约80%～90%)时传代，第3代时得到老练纯化的星形胶质细胞，用GFAP行免疫荧光法判定，荧光显微镜下星形胶质细胞比率95%，用于后续试验。将纯化的星形胶质细胞栽培于24孔板中，参加4%多聚甲醛(碧云天生物科技有限公司)固定30 min，PBS重复漂洗细胞，先后选用0.1%Triton X-10(碧云天生物科技有限公司)破膜、5%BSA(碧云天生物科技有限公司)关闭细胞，孵育相应一抗GFAP抗体(稀释度1∶1 000，Abcam公司，英国)，4 ℃过夜。次日避光孵育相应二抗(稀释度：1∶500，碧云天生物科技有限公司)，PBS漂洗后孵育DAPI(碧云天生物科技有限公司)，最终运用抗荧光淬灭剂封片(碧云天生物科技有限公司)，运用共聚集显微镜搜集图画，图画选用Image J软件剖析。选用随机数字表法分为5组(n＝16)：对照组(C组)、OGD/R组(O组)、OGD/R+miR-205-3p模仿物组(M组)、OGD/R+miR-205-3p抑制剂组(I组)和OGD/R+miR-205-3p阴性对照组(NC组)。
由广州锐博生物技术有限公司供给miR-205-3p模仿物，miR-205-3p抑制剂和阴性对照，参照riboFECT™CP转染试剂说明书依据试验浓度将其别离与星形胶质细胞于37 ℃、5%CO 2 的培育箱培育48 h，48 h后运用qRT-PCR法检测转染成功。
选用10%胎牛血清装备的DMEM/F12培育基培育星形胶质细胞，当细胞成长状况杰出时，将各组细胞的彻底培育基换为无糖培育基，并将细胞培育板置于37 ℃厌氧孵育箱(含94%N2、1%O2和5%CO2)氧糖掠夺4 h，无糖培育基更换为正常培育基，持续培育24 h。
于复糖复氧24 h时，各组随机取5孔细胞，依据Trizol试剂说明书进程提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度合格，－80 ℃保存备用。选用Takara反转录试剂盒将总RNA中的mRNA反转录成cDNA，产品进行PCR。运用miRNA提取别离试剂盒(天根生化科技有限公司)提取细胞miRNA，紫外分光光度计测定RNA浓度合格，运用miRNA cDNA榜首链组成试剂盒(天根生化科技有限公司)将miRNA反转录成cDNA，产品进行PCR。别离运用miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)和mRNA的TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(Takara公司，日本)制备PCR反响系统，并于ABI7300荧光实时定量聚合酶链反响仪(CA公司，美国)检测AQP4 mRNA和miR-205-3p表达。AQP4引物：上游5′-TCAGCATCGCTAAGTCCGTC-3′，下流：5′-CGTGGTGACTC-CCAATCCTC-3′，内参为GAPDH(上海生工生物工程股份有限公司)。miR-205-3p引物：上游5′-CTTGTCCTTCATTCCACCGGA-3′，内参为U6(上海生工生物工程股份有限公司)。选用2-ΔΔCT法核算AQP4 mRNA和miR-205-3p的相对表达量。
于复氧复糖24 h时，各组随机取3孔细胞，别离消化，参加RIPA细胞裂解液，在冰浴条件下裂解细胞。提取各组细胞总蛋白后用BCA法检测蛋白浓度。运用SDS聚丙酰胺凝胶孔槽，电泳，确认方针蛋白的片段巨细及方位后切胶，转印聚偏乙烯膜，加关闭液室温关闭1 h，参加方针蛋白一抗AQP4(稀释度1∶2 500，Sigma公司，美国)、porimin(稀释度1∶500，Immunoway公司，美国)4 ℃孵育过夜，二抗(稀释度1∶1 000，北京中杉金桥科技公司)室温孵育2 h，以β-actin(稀释度1∶10 000，武汉三鹰生物技术有限公司)为内参。化学发光法闪现蛋白条带并照像，Image J软件剖析灰度值，以意图蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映意图蛋白的表达。
选用CCK-8法，各组随机取5孔处于对数成长期细胞，每孔参加单细胞悬液100 μl，空白孔参加等量的培育基，置于37 ℃、5%CO2培育箱中孵育，于复氧复糖24 h后于各组参加10 μl CCK-8溶液(碧云天生物科技有限公司)，避光温箱孵育1 h后，置于酶标仪(PerkinElmer公司，美国)用450 nm单波长测吸光度值(OD值) ，细胞生机＝(试验组OD值－空白组OD值)÷(对照组OD值－空白组OD值)，选用不一样繁衍批次细胞重复5次试验，取其平均值。
于复氧复糖24 h时，各组随机取3孔细胞，依据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)说明书搜集处理各组细胞，参加195 μl Annexin V-FITC结合液悄悄重悬细胞后参加5 μl Annexin V-FITC，悄悄混匀。再参加10 μl碘化丙啶染色液，悄悄混匀后室温避光孵育15 min，随后立即用流式细胞仪检测各组星形胶质细胞损害和胀亡状况。
选用SPSS 25.0软件做多元化的剖析，正态散布的计量材料以均数±标准差标明，组间比较选用单因素方差剖析，P0.05为差异有统计学含义。
表3与C组比较，O组星形胶质细胞AQP4及其mRNA表达上调，细胞损害率及胀亡率升高(P0.05)；与O组比较，M组星形胶质细胞AQP4及其mRNA表达下调，胞损害率及胀亡率下降，I组星形胶质细胞AQP4及其mRNA上调，细胞损害率及胀亡率升高(P0.05)，NC组差异无统计学含义(P0.05)。见表3。
本研讨选用厌氧孵育箱(含94%N2、1%O2和5%CO2)氧糖掠夺4 h，无糖培育基更换为正常培育基，持续培育24 h的办法制备星形胶质细胞OGD/R模型，依据成果得出，与C组比较，O组细胞生机下降，细胞损害率及胀亡率升高，提示模型制备成功。
星形胶质细胞在脑中广泛存在，是中枢神经系统中数量最多的神经胶质细胞，可组成和排泄多种细胞因子，具有养分支撑神经元、保持血脑屏障完好、调控细胞微环境等神经维护效果[12,13]。星形胶质细胞胀亡的产生可引起细胞毒性水肿，细胞毒性水肿是引起脑水肿的原因之一。脑水肿是缺血性脑卒中潜在的一种严峻并发症[14]。AQP4是中枢神经系统中水通道蛋白的首要亚型，是大脑中丰厚的水通道，在星形胶质细胞中高表达，首要散布于星形胶质细胞的终足处[15]，是脑水肿产生进程的首要参加者，星形胶质细胞产生细胞毒性水肿的进程依赖于AQP4的表达[16]。AQP4参加脑脊液的构成和重吸收，保持脑稳态，是调理星形胶质细胞功用的要害蛋白。研讨标明，AQP4的表达下调或缺失会导致星形胶质细胞功用障碍，如细胞膜水通透性下降[17]，细胞成长和搬迁功用受损[18]等。porimin是一种高度糖基化的跨膜受体蛋白，归于细胞膜相关粘蛋白宗族。其可导致细胞产生一种共同方法的逝世方法即胀亡。当在缺氧、供能缺乏等状况下，porimin可被激活，敏捷与其配体抗-porimin mAb结合，经过引起各种膜性结构的损害如细胞膜通透性增加等，从而产生细胞胀亡。在细胞产生胀亡时，porimin可被激活[19]，特异性地表达在即将产生胀亡的细胞外表[20]。本研讨依据成果得出，与O组比较，M组miR-205-3p表达上调，细胞生机升高，细胞损害率及胀亡率下降，AQP4及其mRNA和porimin表达下调，I组miR-205-3p表达下调，细胞生机下降，I组细胞损害率及胀亡率升高，AQP4及其mRNA和porimin表达上调，结合miR-205-3p与AQP4 3′-UTR存在结合位点，提示miR-205-3p参加了OGD/R星形胶质细胞胀亡的进程，与调控AQP4表达有关。
综上所述，miR-205-3p参加了OGD/R星形胶质细胞胀亡的进程，与调控AQP4表达有关。