发布日期： 2025-03-07 07:17:28 来源：贝博BB平台app免费下载
为了研讨基因或RNA的功用，常常要将RNA转化为更安稳的cDNA，以便能用于克隆、PCR、测序和文库构建等试验。
为了研讨基因或RNA的功用，常常要将RNA转化为更安稳的cDNA，以便能用于克隆、PCR、测序和文库构建等试验。在回转录酶(或称逆转录酶)的效果下，以RNA(mRNA)为模板组成单链互补DNA(Complementary DNA, cDNA)的进程称为回转录(Reverse Transcription, RT)，然后以单链cDNA为模板进行PCR，扩增意图基因全⻓或部分片段的进程则称为回转录PCR，也即RT-PCR。
MMLV有着十分强的聚合酶活性，其RNaseH活性较弱，最适反响温度为37℃，而AMV的聚合酶活性和RNaseH活性均很强，最适反响温度为42℃，因而MMLV适用于组成较⻓的片段，可是其反响温度较低，关于含有杂乱二级结构的RNA回转录存在困难。相对而言，AMV的反响温度比较高，更适合具有杂乱结构的RNA回转录，其聚合酶活性也很强，往往能回转录得到较多的cDNA分子，可是其RNaseH活性也较强，导致其组成的片段一般较短。
现在有许多公司对两种回转录酶都进行了基因工程改进，使其具有较高的聚合酶活性和反响温度，一起RNaseH活性也下降，从而能组成更⻓的cDNA片段。回转录所用的引物，一般是依据mRNA的3端含有一段poly A“尾巴”的特性，组成一段寡聚T如oligo(dT)15-18作为回转录的开始引物。此外，也可通过⻓度为6nt的随机引物进行回转录。
试验设备:PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射检测仪、台式离心机、凝胶成像仪；试验用具: 0.2 mL 薄壁PCR管、吸管头、微量移液器、1. 5 mL 离心管、离心管架。
(5)RT-PCR: 以回转录得到的单链cDNA为模板，运用高保真的TagDNA聚合酶进行PCR。对基因组DNA也进行相同的扩增，以此作为检测cDNA样品中是否含有基因组DNA污染的对照。以基因特异引物进行PCR，程序一般为: 94℃预变性4min，然后94℃变性30s，55-58℃退火30s，72℃延伸60-90s，循环30-35次；最终72℃保温10min。(5) 按以下份额制造反响液，混匀进行PCR。
1. 回转录时有必要防止RNase的污染。在组成cDNA榜首链时，应运用RNase抑制剂(回转录试剂盒中一般都包括此试剂)。进行RT-PCR时，尽管组成cDNA榜首链的RNA模板正常状况下不会对PCR有较大影响，可是假如扩增的片段较⻓，主张运用RNaseH消化掉RNA/cDNA杂交链中的RNA，以削减RNA的搅扰 。