发布日期： 2024-10-02 11:40:59 来源：贝博BB平台app免费下载
1西安交通大学隶属红会医院麻醉科 710054；2空军军医大学西京医院消化急诊科，西安 710032；3空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科，西安 710032
陕西省自然科学基础研讨方案一般项目（2019JQ‑979，2020JM‑330）；西安市Ⅰ类项目（201901005）
本研讨拟点评G蛋白耦联受体1（GPR30）特异性激动剂G1对氧糖掠夺/复氧（OGD/R）损害后原代神经元细胞氧化应激方针的影响以及核因子E2相关因子2（Nrf2）通路在其间的效果。
将原代培育的皮质神经元细胞分为6组（每组6孔）：C组、OGD/R组、溶剂组、G1组、G1+对照病毒组和G1+Nrf2慢病毒组。C组，不做任何处理；OGD/R组，OGD 2 h 后康复氧糖；溶剂组，OGD 2 h后在培育液中参加适量溶剂，持续培育22 h；G1组，行OGD/R模型，复氧复糖后的正常培育液中参加终浓度为5 μmol/L的G1，持续培育22 h；G1+对照病毒组，感染对照慢病毒的原代神经元细胞行OGD/R模型，其他处理同G1组；G1+Nrf2慢病毒组，感染了Nrf2 shRNA慢病毒的原代神经元细胞行OGD/R模型，其他处理同G1组。
显微操作取孕18 d的C57BL/6胎鼠脑安排，除掉脑膜和微血管，当心别离皮质，剪碎，0.25%胰酶消化15 min，用含10%胎牛血清的达尔伯克有必要根本培育液中和，1 000 r/min×10 min离心，弃上清，用含2% B27的Neurobasal培育液悬浮细胞，以2 500个/mm2接种于经多聚赖氨酸包被的培育板中。之后每3 d半量换液，持续37 ℃、5%CO2+95%O2条件下培育。
取培育至7 d的原代皮质神经元细胞，运用无糖改进的达尔伯克根本培育液代替正常细胞培育液，并将其置于37 ℃、5%CO2+95%N2的混合气体培育箱，氧糖掠夺2 h后换成正常细胞培育液，然后置于37 ℃、5%CO2的细胞培育箱中持续培育22 h。
原代神经元以2 500个/mm2密度接种于6孔板，每孔加培育液3 ml，成长至4 d。依据上海吉凯生物公司的慢病毒手册，在1 ml Neurobasal中参加6 g/L聚凝胺1 µl，在含有聚凝胺的培育液中参加对照慢病毒或Nrf2 shRNA慢病毒，方针序列为5‑CGCTGAGTACTTCGAAATGTC‑3，1板加对照慢病毒，1板加Nrf2 shRNA慢病毒。转染12 h后更换为正常培育液，72 h后经过倒置荧光显微镜调查细胞绿色荧光蛋白的表达，并剖析病毒转染功率，接着进行OGD/R试验。
1.5ELISA法检测活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化才能（T‑AOC）水平
严厉依照SOD试剂盒、T‑AOC试剂盒、MDA试剂盒和ROS试剂盒阐明书进行。
依照蛋白提取试剂盒阐明，提取各组蛋白，蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取20 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法将电泳产品转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉常温关闭1 h，别离参加一抗Nrf2、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）、组蛋白，4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶符号的二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，滴加发光液后在凝胶成像仪收集图画。以意图蛋白与内参的比值标明意图蛋白的相对表达量。
将培育的原代神经元细胞爬片4%多聚甲醛固定5 min，然后用PBS冲刷3遍，每遍5 min，参加一抗MAP‑2和Nrf‑2，4 ℃过夜，接着用PBS冲刷3遍，每遍5 min，参加抗兔荧光二抗和抗鸡荧光二抗，用防淬灭封片机封片。然后用荧光显微镜调查，统计剖析。
神经元细胞以2 500个/mm2的密度接种于96孔板，每孔加培育液100 µl，成长至7 d。每组随机取6孔细胞，用分光光度法测定培育液LDH活性。每孔汲取50 μl培育液参加50 μl测定试剂，37 ℃孵育30 min，用酶标仪490 nm测定光密度（D）值。
神经元细胞以2 500个/mm2的密度接种于96孔板，每孔加培育液100 µl，成长至7 d。各组均参加含10% CCK‑8溶液的Neurobasal培育液，37 ℃孵育2 h。每个浓度设置6个复孔，酶标仪450 nm处测定其D值。
2.2G1对皮质神经元OGD/R损害后Nrf2总蛋白水平缓核内蛋白水平的影响
与C组比较，OGD/R组和溶剂组Nrf2总蛋白水平缓核内蛋白水均匀升高（P0.05）；与OGD/R组比较，G1组Nrf2总蛋白水平缓核内蛋白水平升高（P0.05）。见图2。
与G1组及G1+对照病毒组比较，G1+Nrf2慢病毒组细胞生机、SOD和T‑AOC含量下降，LDH、ROS及MDA含量升高（P0.05）；G1组与G1+对照病毒组各方针比较，差异均无统计学含义（P0.05）。见图3。
本研讨标明，与OGD/R组比较，G1组ROS和MDA含量下降，SOD和T‑AOC含量升高，反映细胞损害所造成的程度的LDH含量下降，提示G1能够终究靠添加内源性抗氧化才能下降神经元OGD/R损害发挥神经维护效应。
本研讨依据成果得出，与C组比较，OGD/R组Nrf2蛋白水平升高；与OGD/R组比较，G1组Nrf2的含量进一步升高；提示G1能够上调OGD/R损害后神经元Nrf2的表达量。使用慢病毒下调神经元Nrf2成果为：与G1组及G1+对照病毒组比较，G1+Nrf2慢病毒组LDH、ROS和MDA含量升高，细胞生机、SOD和T‑AOC含量下降。