发布日期： 2024-11-10 01:05:36 来源：贝博BB平台app免费下载
18-24 hr 去除培育液 培育 PBS 清洗细胞 3-4 hr 参加传统转染试剂 /DNA 复合物 温育 替换培育液 培育 24-48 hr 转染成果剖析 r 细胞接种 传统转染试验程序
产品介绍： 基因转染需求必定的转染试剂将带有意图基因的载体运送到细胞内。现在，最常
用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们的特色和病毒相似，简略透过细 胞膜。其间，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的功率，但是在体内，它敏捷被 血清铲除，在肺安排内累积，诱发激烈的抗炎反响，这将导致高水平的毒性，因而， 在很大程度上约束了其运用。因为阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日 益受到重视。 本试剂选用专利配方的阳离子聚合物为首要成分，可以与 DNA 构成安稳的复合 物，维护 DNA 免受核酸酶的降解,在添加核酸安稳性的一起, 进步转染试剂/DNA 复合 体穿越细胞膜的功率，这种共同规划，显着进步了基因转染功率。此类试剂是现在非 病毒介导办法中功率最高的转染试剂（不一样的品种细胞的转染功率可有显着差异） 。此外 GenFectinTM 不被血清铲除，血清和抗生素不影响其转染作用，转染试剂/DNA 复合物 可以直接参加彻底细胞培育基中。GenFectinTM 的细胞毒性很小，在适合的条件下，根 据引荐用量运用 GenFectinTM 进行转染试验，细胞存活率高于 90%.每一批产品出厂前 都要对其转染功率和毒性通过严厉质控。
适用范围及特色： 适应于许多原代培育细胞和转化细胞株的基因转染 适用于瞬时转染和安稳转染 适应于贴壁细胞和悬浮细胞转染 转染功率高且安稳，在有无血清存在的细胞培育基中均能取得高功率转染 细胞毒性低 转染程序简略，转染试验可以在半小时内完结
转染进程的优化： 影响转染功率的要素有许多，细胞自身的特性和状况、转染试剂的用量、转染的
DNA 用量、转染试剂/DNA 复合物份额、构成的复合物的形状巨细、细胞数/细胞密度、 细胞和转染复合物触摸孵育的时刻等等都可能会影响转染作用，应该在详细实践中优化 来承认最佳转染条件。优化后，关于同一细胞株，今后依照相同条件进行。
安稳转染时，于转染后 24~48 小时消化细胞分至 3~5 个培育皿中，加恰当浓度的 相应抗生素（如 G418）挑选。
GenFectin TM基因转染试剂 目录号 2101 运用手册 试验室运用，仅用于体外
假如细胞株很灵敏， 孵育 2-4 小时后除掉转染复合物并参加含血清的新鲜培育基。
操作办法： 所需其它试剂： 运用者需预备 150 mM NaCl （超纯水制造，高压或过滤灭菌） 或注射用生理盐水作为 GenFectinTM 及 DNA 的稀释液， 和要转染的 DNA 溶液 （高 纯度，浓度 0.1~2μ g/ μl） 。
1. 质粒浓度太低-主张：运用最适合的质粒数量。 2. 质粒纯度太低-主张：运用高质量的质粒(OD260/2801.8) 。 3. 细胞成长状况欠佳-主张：确保细胞密度和形状是最佳的。 4. 进一步削减转染时培育液体积（转染后 6~16 小时再补加足量培 养液）。 转染功率低 5. 从开端用量开端，调整制造转染液中 DNA 和 Genfectin TM 的用量 （坚持转染作业液整体积不变），以承认不同细胞的最佳转染条 件。一般固定 DNA 用量（5 μg），与系列含量的 Genfectin TM 混 合，选取 Genfectin TM 的最佳用量；也可固定 Genfectin TM 用量 （2 μl），与系列含量的 DNA 混合，选取 DNA 的最佳用量；还 可以固定 GenFectin TM/DNA 比率添加或，者削减质粒的用量。 6. 建立阳性对照，例如 GFP Gene 和 luciferase Gene-主张：以便检 查转成果。 1. 接种前，细胞的健康情况直接影响细胞毒性。 2. 转染时细胞密度不能过低。 3. 添加转染时培育液体积，或坚持 GenFectin TM/DNA 比率的一起减 细胞毒性太大 4. 对某些灵敏的细胞株，转染后 3~4 小时去除含转染复合物的培育 液，替换为新鲜的彻底培育液。 5. 承认基因产品是否有毒性。 6. 承认质粒没有内毒素。 少质粒的用量。
将稀释的 GenFectinTM 逐滴参加稀释的 DNA 溶液中，悄悄混匀，所得的转染作业 液在室温放置 15 分钟。
将转染作业液悄悄混匀，逐滴参加 2 ml 培育液中，悄悄混匀培育液，置 37℃，5% CO 2 培育。
制造转染作业液： （ 6 孔板或 35 mm 平皿， 2 ml 培育液） 取 5~8μ g DNA （开端用量 5μ g） ，参加稀释液中至整体积为 100μ l，悄悄混匀，室 温放置。
细胞接种： 为了取得最好的转染功率，细胞密度应该 40-80%，这因细胞株的不同而改变，对 最常用的细胞株主张细胞密度 50-60%。最理想条件是在转染前 18-24 小时，接种 适量细胞置 37℃，5% CO2 培育。 （引荐接种细胞数量见附表）
转染前一个小时能考虑替换一次新鲜的培育液，体积可参阅附表。 但是，对细胞毒性不灵敏的细胞株可在细胞贴壁后 (接种几小时后 )即进行转染或 者在细胞接种后当即进行转染也可以取得附近的成果。
注意事项： 少数运用 GenFectinTM 时， 可取准确量的 GenFectinTM 用无菌超纯水稀释必定倍数， 以便准确取样量。该稀释液可在 4℃保存 1 月左右。
细胞的成长状况是转染功率的一个首要决定要素。在试验条件答应的情况下，使 用高质量的培育液、优质血清等，可能会明显提高转染功率。